基因沉默（RNAi）及siRNA设计详解剖析
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阅读： 2022/3/30 17:48:29
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RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导目标基因的沉默，能够迅速阻断基因活性。
RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。
常用的RNAi的研究策略
一、直接合成针对靶基因的siRNA 。(合成的是RNA,不是DNA)
通过转染（有用于siRNA转染的试剂）的方法使之进入细胞内，参与到RNAi途径，发挥使靶基因沉默的效应。这一方法受转染效率的影响较大，而且能顺利的进入RNAi途径的效率怎么样，还有待验证。不过目前有不少基因的siRNA已经有商业产品，所以使用时买来就可以了，比较方便。
而且直接合成的siRNA可以进行小分子多肽等配体标记，可进行体内研究，注入体内后，通过配体的识别，被特定的细胞吸收，在特定的靶细胞内实现RNAi研究。
二、构建shRNA的质粒表达载体。
shRNA质粒转染细胞，在细胞内转录生成shRNA,利用细胞内的Dicer酶，生成相应的siRNA，发挥RNAi作用。
三、构建shRNA的病毒表达载体。
常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。
siRNA寡聚核苷酸设计原则:
1. siRNA的设计是决定RNAi实验成败关键性的第一步。
并非每个siRNA都能有效引发基因沉默。和引物设计一样，设计有效的siRNA也有一些经过前人经验总结出的规则，而且这些规则随着对siRNA研究的深入也在不断完善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高，3个保证中2个。
2. siRNA的反义链3'端最好以UU结尾，这被公认是最有效的的siRNA结构。
现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi，你可以尝试。不过如果是体外转录合成siRNA，要避免以G结尾，因为后继处理时RNase会切除末端的G。
3. 多个siRNA位点最好分散分布在mRNA全长上。
没有数据表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特别的关系。如果siRNA位点因为mRNA二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果，分散分布可以减少风险。
4. 避开和其他基因同源序列，以免“误伤群众”。
潜在的目标序列都到NCBI BLAST一下，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST，和其他基因有碱基同源的序列一定枪毙掉。
5. GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。
有较多选择时留意，不要有连续3个以上的GC，也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章，由于siRNA双链上只有一条链会结合RISC上，究竟哪条链取决于RNA解旋酶，而正义链5'端以GC开头，且5'端1－4个碱基GC含量高，且16－19位碱基GC含量低的序列，得到的siRNA反义链5'端GC含量低，3'GC含量高（也有研究表明反义链5'端前7个碱基至少有5个AU），使得反义链比较容易正确结合RISC，因而基因沉默效果比较好。
如果是shRNA表达载体，用的是RNA聚合酶III类的启动子如U6，最适合的结构是5’GN，后面连续4个U结尾即可令转录终止，要避免序列中G，减出现连续的U/A。
6. 一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNAs，平行实验以期提高成功率。
据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。
siRNA设计工具
研究人员自建的设计工具，以及一些公开的siRNA信息数据库，仅供参考。
Whitehead Institute开发的工具（可以自定义你认为有用的计算法则，删除你认为不需要的法则，而且会不断检索最新的法则并添加进去）：http://jura.wi.mit.edu/siRNAext
siSearch (可以给设计结果评分)：http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.7.html
sFold：http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl
RNAi Codex：http://codex.cshl.edu/scripts/newmain.pl
siRNA User Guide (by Tom Tuschl)：http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html
shRNA Designer：http://shRNAdesigner.med.unc.edu
商家免费工具：
1. Ambion公司：http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
2. Dharmacon公司siRNA设计:http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx
3. Dharmacon公司Seed Locator：http://www.dharmacon.com/seedlocator/default.aspx
4. Promega公司：http://www.promega.com/siRNADesigner/
5. Invitrogen公司：https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/
6. Genelink公司：http://www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp
化学合成siRNA
目前化学合成的siRNA主要有：普通siRNA、化学修饰siRNA和荧光标记siRNA。
化学修饰siRNA：可以增强siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与普通的siRNA相比，延长了作用时间。
荧光标记siRNA：在化学合成siRNA时，可以对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记。标记后的siRNA可用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等观察到，确定转染效率，优化转染条件；标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
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