if10.7-协和等揭示补骨脂二氢黄酮甲醚靶向PCNA促进再生改善NAFLD
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阅读： 2023/7/21 8:40:43
本期为大家分享的是北京协和医学院孙晓波教授团队于2023.2.16在Journal of Advanced Research上online的研究论文“Bavachinin protects the liver in NAFLD by promoting regeneration via targeting PCNA”，本文发现补骨脂中活性化合物补骨脂二氢黄酮甲醚能够靶向PCNA促进肝再生，保护高脂肪饮食诱发的非酒精性脂肪肝。
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全世界最常见的肝病，目前尚无获批用于治疗NAFLD的药物。补骨脂是我国传统中药，具有温肾助阳、平喘止泻等功效，补骨脂二氢黄酮甲醚（BVC）是一种从补骨脂中分离出来的一种活性成分，在体外和体内均有促进肝脏再生的作用，目前已被证明对NAFLD具有保肝作用，但其作用机制尚不明确。增殖细胞核抗原(PCNA)在细胞分裂过程中通过与DNA聚合酶δ (Pol δ)或p21相互作用调节DNA合成。PCNA与Pol δ结合可以促进DNA的合成，PCNA与 p21相互作用会干扰Pol δ功能，因此PCNA一直被用作增殖或再生标志物。因此，作者基于CC-ABPP技术设计合成了BVC的小分子探针，并对BVC的靶标进行钩钓，结果表明BVC通过靶向PCNA促进肝脏再生来改善NAFLD。
为了研究BVC对高脂肪饮食诱导的NAFLD的缓解效果，作者用高脂肪饮食HFD喂养仓鼠2周确保仓鼠患上高脂血症，然后每天以50和100 mg/kg/天的剂量对HFD诱导的NAFLD仓鼠口服BVC，以ATO为阳性对照，发现不同剂量的BVC能降低仓鼠体重、肝脏系数、血脂水平和LDL水平（图1），减轻HFD引起的肝损伤（图2）。
同时，为了确定BVC可减轻NAFLD巨噬细胞的炎症，作者检测了巨噬细胞分泌的IL-6和TNF-a的水平，结果表明，饲喂高脂饲料可提高IL-6和TNF-a基因的表达，而50和100 mg/ kg BVC均可降低其表达（图3）。表明BVC治疗可以减轻NAFLD的炎症。
为了识别BVC的目标，作者合成了BVC探针（XQ），结构如图（图4A），确保它们具有相似的抗脂毒作用，然后将XQ与HepG2细胞蛋白裂解液孵育，进行点击化学反应。结合到XQ的蛋白质被链亲和素珠从蛋白质裂解液中捕获（图4B），然后洗脱下来电泳发现在XQ泳道中35和45 kDa之间有2个明显的条带（图4C），可能是BVC的靶蛋白，于是将这些蛋白分离、酶解，然后进行LC-MS/MS鉴定。比对发现，增殖细胞核抗原(PCNA, 36 kDa)得分较高，该蛋白与肝脏再生密切相关，因此，推测PCNA是BVC抗NAFLD的靶点。
随后，作者进行了各种验证实验来验证BVC与PCNA之间的相互作用。先是做了CETSA、DARTS和SPR实验来评估药物与靶蛋白的结合（图5），这些结果均表明BVC与PCNA直接结合，并确定了BVC的增殖作用在8 h内开始，培养16 h后，细胞的生长速度趋于减慢。
为了预测BVC与PCNA的结合位点和模式，作者利用AutoDockTools (ADT)软件构建BVC-PCNA复合物模型（图6A），计算了BVC与不同结合位点的结合能，发现BVC更适合Pol δ和p21结合的口袋处，所构建的模型预测BVC与PCNA的ASP-10有接触。接下来，作者进行Co-IP实验，探讨不同浓度的BVC对Pol δ或p21与PCNA结合的影响，发现BVC可显著增强PCNA与Pol δ的结合，抑制p21与PCNA的结合（图6B）。
作者通过研究结果表明，BVC除了具有降脂作用外，还与PCNA的口袋结合，可以促进PCNA与Pol δ的相互作用，同时竞争性地抑制p21与PCNA的相互作用，促进细胞在体外的增殖。体内实验与体外实验结果相似，在NAFLD仓鼠肝再生实验中发现BVC对仓鼠肝脏再生有促进作用，保护肝细胞，从而抑制肝细胞凋亡。
转自：“如沐风科研”微信公众号
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